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Arraystar表观转录组芯片应用案例

作者: 时间:2019-12-12 07:44

讨取康成Arraystar 澳门赌场在线试玩m6A单碱基分辨率芯片技能资料

美国威斯康星大学Raghu Vemuganti教授长时间从事ncRNA及脑损伤相关研讨。近期,其试验室使用Arraystar mouse mRNA lncRNA表观转录组芯片 ,初次发现在小鼠时间短部分性缺血12小时并再灌注后,122个mRNA和17个lncRNA的m6A润饰水平上升,15个mRNA和3个lncRNA的m6A润饰水平下降。经过GO/pathway剖析发现m6A润饰水平改动的mRNA显着富集到炎症、细胞凋亡和转录调控等生物学进程。m6A润饰水平的改动或许是由去甲基化酶FTO表达下调引起。该研讨成果于2019年8月宣布在Stroke 。

康成生物丨数谱生物是Arraystar我国区仅有代理商,独家为您供给从样品到数据剖析的全程一站式技能服务。

研讨布景
缺血性脑卒中后神经元的命运由一系列杂乱的生化和分子事情决议,包含兴奋性毒性、离子失衡、氧化应激、内质网应激、细胞凋亡和炎症等。缺血敏感性转录组的敏捷改动能够促进这些进程的发作。此外,RNA的转录后水平调控能够精密调理缺血后病理生理改动,如非编码RNA、RNA结合蛋白和表观转录后润饰等。最近的研讨标明,RNA上存在一百多种不同的化学润饰,能够在转录后水平调控RNA,其间m6A是含量最丰厚的化学润饰,能够调控mRNA的剪接、运送、定位、翻译和降解。在哺乳动物细胞中,甲基转移酶METTL3、METTL14和WTAP催化m6A润饰的构成。而去甲基化酶FTO和ALKBH5介导去甲基化。并且FTO在脑中高度富集,其缺失导致多巴胺能神经元神经传递受损和先天性小头变形。近期研讨标明心肌缺血可导致操控心肌细胞缩短功用mRNA的m6A润饰水平上升。m6A润饰在哺乳动物脑中丰度最高,能够调控突触可塑性、轴突生长、学习回忆和应激反响。但m6A润饰缺血性脑损伤中的效果尚不清楚,为此文章作者检测了时间短部分性脑缺血对mRNA和lncRNA上m6A润饰的影响。

技能道路

成果展现

1. 预试验:dot blot证明时间短部分性缺血后m6A润饰总体水平升高。

为探求小鼠大脑时间短部分性缺血后,m6A润饰总体水平的改动,作者别离选取缺血3h、6h、12h和24h时雄性小鼠和对照小鼠大脑进行dot blot试验,发现12h和24h时,m6A水平显着上升。在雌性小鼠中,时间短缺血24h时,m6A水平显着上升。


图1. 小鼠大脑时间短部分缺血后m6A水平显着上升。

2. 高通量挑选:Arraystar mouse 表观转录组芯片证明时间短部分性缺血后显着改动特定RNA的m6A润饰水平。

确认时间短部分性缺血可导致RNA m6A总体水平显着升高后,作者使用MeRIP和Arraystar 表观转录组芯片,检测了时间短部分性缺血12h时小鼠大脑中mRNA和lncRNA的m6A润饰水平。芯片共检测到44122个mRNA转录本和12496个lncRNA转录本,其间127个mRNA和20个lncRNA的m6A水平发作显着改动。其间95% RNA的m6A润饰水平显着上升,只要5% RNA的m6A润饰水平下降。然后作者选取6个mRNA和2个lncRNA 分子,使用MeRIP-qPCR检测了m6A润饰水平的改动,成果与Arraystar表观转录组芯片成果相符。

 
图2. 时间短部分缺血后m6A润饰水平上升的mRNA及lncRNA显着多于润饰水平下降的RNA。


图3. 使用MeRIP-qPCR验证4个m6A润饰上升的RNA和4个m6A润饰下降的RNA。m6A的reader蛋白YTHDF1和YTHDF3在时间短缺血24h时表达上升。

3. 生信剖析:m6A润饰发作显着改动的RNA显着富集到炎症、细胞凋亡和转录调控等生物学进程。

为确认m6A润饰发作显着改动的mRNA的功用,作者进行了GO/pathway剖析,发现相关mRNA显着富集到炎症、细胞凋亡和转录调控等生物学进程,细胞因子活性、蛋白酶结合、转录激活因子和转录按捺因子活性等分子功用,以及GPCR信号、细胞因子信号、肿瘤坏死因子信号等KEGG通路,已有研讨标明这些通路能够调控缺血性脑损伤。m6A润饰水平的改动或许影响了mRNA的翻译和lncRNA的功用,从而影响了脑缺血后细胞的命运。


图4. 对m6A润饰发作显着改动RNA的GO/pathway剖析成果。

4. mRNA qPCR/WB:去甲基化酶FTO在时间短缺血后表达下调。

为确认m6A润饰水平上升的原因,作者别离检测了时间短缺血后m6A writer、reader和eraser的表达量,发现reader基因YTHDF1和YTHDF3只在缺血24h时表达上升,writer基因METTL3、METTL14和 WTAP的表达量不变,eraser基因FTO表达显着下降。免疫染色试验标明FTO主要在神经元中表达。阐明m6A润饰水平的升高或许是由去甲基化酶FTO表达下调引起。


图5. 时间短缺血后FTO的mRNA和蛋白表达以及酶活性均下降。


图6. FTO主要在神经元中表达。NeuN+是神经元细胞标志性蛋白,GFAP+是星形胶质细胞标志性蛋白,IBA1+是小胶质细胞标志性蛋白。

研讨含义

该课题组凭借Arraystar表观转录组芯片检测了小鼠时间短部分性脑缺血后mRNA和lncRNA上m6A润饰水平的改动。发现m6A润饰发作改动的RNA中大多数是润饰水平上升的,这些RNA显着富集到炎症、细胞凋亡和转录调控等生物学进程。m6A润饰水平的改动或许是由去甲基化酶FTO表达下调引起。该研讨初次标明小鼠脑卒中显着改动RNA的m6A润饰水平,这或许对脑卒中后的病理生理学改动具有重要影响。

文章出处

Transient Focal Ischemia Significantly Alters the m6A Epitranscriptomic Tagging of RNAs in the Brain

美国威斯康星大学Raghu Vemuganti教授长时间从事ncRNA及脑损伤相关研讨。近期,其试验室使用Arraystar mouse mRNA lncRNA表观转录组芯片 ,初次发现在小鼠时间短部分性缺血12小时并再灌注后,122个mRNA和17个lncRNA的m6A润饰水平上升,15个mRNA和3个lncRNA的m6A润饰水平下降。经过GO/pathway剖析发现m6A润饰水平改动的mRNA显着富集到炎症、细胞凋亡和转录调控等生物学进程。m6A润饰水平的改动或许是由去甲基化酶FTO表达下调引起。该研讨成果于2019年8月宣布在Stroke 。

康成生物丨数谱生物是Arraystar我国区仅有代理商,独家为您供给从样品到数据剖析的全程一站式技能服务。

研讨布景
缺血性脑卒中后神经元的命运由一系列杂乱的生化和分子事情决议,包含兴奋性毒性、离子失衡、氧化应激、内质网应激、细胞凋亡和炎症等。缺血敏感性转录组的敏捷改动能够促进这些进程的发作。此外,RNA的转录后水平调控能够精密调理缺血后病理生理改动,如非编码RNA、RNA结合蛋白和表观转录后润饰等。最近的研讨标明,RNA上存在一百多种不同的化学润饰,能够在转录后水平调控RNA,其间m6A是含量最丰厚的化学润饰,能够调控mRNA的剪接、运送、定位、翻译和降解。在哺乳动物细胞中,甲基转移酶METTL3、METTL14和WTAP催化m6A润饰的构成。而去甲基化酶FTO和ALKBH5介导去甲基化。并且FTO在脑中高度富集,其缺失导致多巴胺能神经元神经传递受损和先天性小头变形。近期研讨标明心肌缺血可导致操控心肌细胞缩短功用mRNA的m6A润饰水平上升。m6A润饰在哺乳动物脑中丰度最高,能够调控突触可塑性、轴突生长、学习回忆和应激反响。但m6A润饰缺血性脑损伤中的效果尚不清楚,为此文章作者检测了时间短部分性脑缺血对mRNA和lncRNA上m6A润饰的影响。


技能道路

成果展现

1. 预试验:dot blot证明时间短部分性缺血后m6A润饰总体水平升高。

为探求小鼠大脑时间短部分性缺血后,m6A润饰总体水平的改动,作者别离选取缺血3h、6h、12h和24h时雄性小鼠和对照小鼠大脑进行dot blot试验,发现12h和24h时,m6A水平显着上升。在雌性小鼠中,时间短缺血24h时,m6A水平显着上升。


图1. 小鼠大脑时间短部分缺血后m6A水平显着上升。


2. 高通量挑选:Arraystar mouse 表观转录组芯片证明时间短部分性缺血后显着改动特定RNA的m6A润饰水平。

确认时间短部分性缺血可导致RNA m6A总体水平显着升高后,作者使用MeRIP和Arraystar 表观转录组芯片,检测了时间短部分性缺血12h时小鼠大脑中mRNA和lncRNA的m6A润饰水平。芯片共检测到44122个mRNA转录本和12496个lncRNA转录本,其间127个mRNA和20个lncRNA的m6A水平发作显着改动。其间95% RNA的m6A润饰水平显着上升,只要5% RNA的m6A润饰水平下降。然后作者选取6个mRNA和2个lncRNA 分子,使用MeRIP-qPCR检测了m6A润饰水平的改动,成果与Arraystar表观转录组芯片成果相符。

 
图2. 时间短部分缺血后m6A润饰水平上升的mRNA及lncRNA显着多于润饰水平下降的RNA。



图3. 使用MeRIP-qPCR验证4个m6A润饰上升的RNA和4个m6A润饰下降的RNA。m6A的reader蛋白YTHDF1和YTHDF3在时间短缺血24h时表达上升。


3. 生信剖析:m6A润饰发作显着改动的RNA显着富集到炎症、细胞凋亡和转录调控等生物学进程。

为确认m6A润饰发作显着改动的mRNA的功用,作者进行了GO/pathway剖析,发现相关mRNA显着富集到炎症、细胞凋亡和转录调控等生物学进程,细胞因子活性、蛋白酶结合、转录激活因子和转录按捺因子活性等分子功用,以及GPCR信号、细胞因子信号、肿瘤坏死因子信号等KEGG通路,已有研讨标明这些通路能够调控缺血性脑损伤。m6A润饰水平的改动或许影响了mRNA的翻译和lncRNA的功用,从而影响了脑缺血后细胞的命运。


图4. 对m6A润饰发作显着改动RNA的GO/pathway剖析成果。


4. mRNA qPCR/WB:去甲基化酶FTO在时间短缺血后表达下调。

为确认m6A润饰水平上升的原因,作者别离检测了时间短缺血后m6A writer、reader和eraser的表达量,发现reader基因YTHDF1和YTHDF3只在缺血24h时表达上升,writer基因METTL3、METTL14和 WTAP的表达量不变,eraser基因FTO表达显着下降。免疫染色试验标明FTO主要在神经元中表达。阐明m6A润饰水平的升高或许是由去甲基化酶FTO表达下调引起。


图5. 时间短缺血后FTO的mRNA和蛋白表达以及酶活性均下降。



图6. FTO主要在神经元中表达。NeuN+是神经元细胞标志性蛋白,GFAP+是星形胶质细胞标志性蛋白,IBA1+是小胶质细胞标志性蛋白。


研讨含义

该课题组凭借Arraystar表观转录组芯片检测了小鼠时间短部分性脑缺血后mRNA和lncRNA上m6A润饰水平的改动。发现m6A润饰发作改动的RNA中大多数是润饰水平上升的,这些RNA显着富集到炎症、细胞凋亡和转录调控等生物学进程。m6A润饰水平的改动或许是由去甲基化酶FTO表达下调引起。该研讨初次标明小鼠脑卒中显着改动RNA的m6A润饰水平,这或许对脑卒中后的病理生理学改动具有重要影响。

文章出处

Transient Focal Ischemia Significantly Alters the m6A Epitranscriptomic Tagging of RNAs in the Brain